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疏水層析中的蛋白洗脫

更新時(shí)間:2022-01-29 點(diǎn)擊次數(shù):4751

蛋白質(zhì)結(jié)合于填料之后,必須再將目標(biāo)蛋白質(zhì)洗脫,并收集層析柱柱后的流出液。多數(shù)情況下,洗脫過(guò)程用于將不需要的蛋白質(zhì)從目標(biāo)蛋白質(zhì)中分離或者去除。不需要的蛋白質(zhì)可能與填料結(jié)合的不是那么緊密,因而會(huì)先于目標(biāo)蛋白質(zhì)被洗脫。另外一些情況下,不需要的蛋白質(zhì)會(huì)與填料結(jié)合更加緊密,并會(huì)在目標(biāo)蛋白被洗脫之后仍與填料結(jié)合。這種情況通常發(fā)生在疏水層析法(HIC)分離蛋白質(zhì)多聚體時(shí),目標(biāo)蛋白多聚體與填料的結(jié)合比單體與填料的結(jié)合更加緊密。在洗脫過(guò)程中,流出液組分可能含有高純度產(chǎn)品,但在其之前或之后也會(huì)含有大量的不需要的蛋白質(zhì)雜質(zhì)。洗脫過(guò)程(梯度洗脫)如圖所示,該圖說(shuō)明用HIC分離純化時(shí),在洗脫步驟中,應(yīng)將柱后流出液進(jìn)行等份收集,這樣才可以獲得適宜純度的產(chǎn)品。

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洗脫過(guò)程可采用等度或梯度的方式進(jìn)行。4種最常見(jiàn)的洗脫結(jié)合蛋白質(zhì)的方法如下:


1、降低鹽濃度(相對(duì)于結(jié)合條件

鹽濃度的降低會(huì)相應(yīng)地減弱蛋白質(zhì)和配基間的疏水作用,進(jìn)而蛋白質(zhì)被解吸附并從層析柱上洗脫下來(lái)。

2、加入有機(jī)溶劑

有機(jī)溶劑(如乙烯或丙二醇)的加入可以改變?nèi)芤旱臉O性,從而可以干擾疏水作用。

3、提供鹽濃度(采用離液鹽)

離液鹽的加入可以干擾疏水作用。

4、加入去污劑

去污劑可以用做蛋白質(zhì)置換劑,主要用于HIC純化膜蛋白。


在洗脫步驟中,將蛋白質(zhì)從HIC填料上洗脫的zui常用方法是降低鹽濃度。用HIC純化新的蛋白質(zhì)組分時(shí),同樣首先采用該方法。上述其他方法的缺點(diǎn)在于,需要額外加入物質(zhì),而這些物質(zhì)可能影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。但是,洗脫與填料結(jié)合比較緊密的蛋白質(zhì)時(shí),還是需要這些試劑的。


以下是月旭科技現(xiàn)有的HIC填料:


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