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液相色譜中分離度變差該怎么辦?

更新時(shí)間:2022-10-20 點(diǎn)擊次數(shù):5148

相信很多小伙伴都遇到過這類情況,色譜柱使用一段時(shí)間后相鄰色譜峰分離度變差,峰形也變寬,或者在做方法開發(fā)時(shí),目標(biāo)物分離度不好。導(dǎo)致這類情況的原因有哪些?遇到問題后該如何排查?今天就和小伙伴們討論交流一下。


在液相色譜中,分離度Rs是色譜分離之中最重要的部分,不管色譜最終的目的是定量定性分析還是樣品制備,都是在一定的分離度基礎(chǔ)上來實(shí)現(xiàn)的。分離度計(jì)算公式如下:

微信截圖_20221020134435.png

其中,Rs表示分離度,tR2表示相鄰峰中后一個(gè)峰的保留時(shí)間,tR1表示相鄰峰中前一個(gè)峰的保留時(shí)間,W1和W2是兩個(gè)峰在基線處的峰寬W。

微信截圖_20221020134445.png

色譜峰的保留時(shí)間相差越大,或者峰形越窄,就能得到更好的分離結(jié)果(分離度增加)。對(duì)于色譜分離來說,基線分離有助于獲得準(zhǔn)確的定量分析結(jié)果。兩個(gè)大小接近的色譜峰,基線分離對(duì)應(yīng)Rs>1.5。

成分離度下降的主要原因有哪些?

從分離度的計(jì)算公式可以看出,造成分離度下降最直觀的原因有:峰形變寬、拖尾或前延,保留時(shí)間發(fā)生變化。所以,導(dǎo)致分離度降低的主要原因有:

1. 色譜柱使用時(shí)間太長(zhǎng),柱效下降了;

2. 色譜柱或者保護(hù)柱或者系統(tǒng)有污染;

3. 樣品被污染變質(zhì),導(dǎo)致峰形變寬、拖尾或前延,或出現(xiàn)雜峰干擾;

4. 儀器柱外死體積過大(管路太長(zhǎng),管路內(nèi)徑太大,檢測(cè)器流通池體積過大等),導(dǎo)致柱效降低,峰形變寬;

5. 柱溫的影響。

分離度降低了,該如何解決?

如果是在日常實(shí)驗(yàn)中,碰到分離度降低的情況,首先要排查色譜柱(包括保護(hù)柱)是否有污染或者失效,對(duì)其進(jìn)行清洗或更換;其次是要排查樣品污染的問題,重新配制樣品進(jìn)行分析;最后排查系統(tǒng)污染和流動(dòng)相污染的問題,清洗儀器管路,更換在線過濾器并更換流動(dòng)相。排除上述幾種可能性,基本就能解決分離度降低的問題。

如果在方法開發(fā)過程中遇到分離度低的情形時(shí),影響因素就有很多了,比如色譜柱類型、填料粒徑、有機(jī)相的種類和比例、緩沖鹽的類型和濃度、柱溫、色譜柱的長(zhǎng)度等。具體的影響以后會(huì)再和大家一一討論。


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